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洗脱 凝胶层析柱特性分析（实验报告）
实验日期：2015年4月21日 实验温度：室温
实验地点：生物化学与遗传学实验室 指导老师：******
班级：2013级生物技术1班 姓名：***** 学号：******
I. 实验目的
1.掌握凝胶层析柱的基本原理；
2.学习凝胶层析柱的操作技术；
3.了解凝胶层析柱的应用。
II. 实验原理
凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入。
因此，在洗脱过程中，大分子物质必然先于小分子物质向下移行，先流出的是大分子物质，小分子物质后流出，从而达到分离的目的。
在凝胶层析中，凝胶粒子间隙的外水相当于移动相，粒子内水相当于固定相。
当溶质随洗脱液自上向下移动时，溶质在内水之间连续不断达成分配平衡。相对分子质量大的因不易渗入凝胶孔内，分配系数较小，用较少的洗脱液就能从柱中洗脱出来；反之，相对分子质量小的因渗入凝胶孔内，分配系数较大，需较多的洗脱液才能从柱中洗脱出来。
为了精确地衡量混合物中某一被分离成分在一定的凝胶柱内的洗脱行为，常采用分配系数Kd来衡量，Kd的定义为：
式中 Ve ——某一成分的洗脱体积，即从加入样品算起，
到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；
Vo ——层析柱内凝胶凝胶颗粒之间空隙的总体积，
又称凝胶外水体积；
Vi ——层析柱内部微孔的总体积，亦称为内水体积。
洗脱体积Ve与Vo及Vi之间的关系可表示为：
Ve=Vo+KdVi
当某种成分的Kd值为0时，意味着这种成分完全被排阻于凝胶建立的微孔之外而最先洗脱出来，即Ve=Vo。可以用一个已知相对分子质量远远超过凝胶排阻极限的有色分子如常用蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，可测出柱床的外水体积Vo。
当另一种成分的Kd=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，在洗脱过程中它将最后流出柱外，Ve=Vo+Vi。
处于上述极端情况（即分子最大与最小）之间的那些分子，它们Kd值在大于0小于1的范围内。由此可见，Kd值得大小序列决定了被分离物质流出层析柱的顺序。Kd只与被分离物质分子的大小和凝胶孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。
将凝胶装柱后，柱床总体积Vt是三种体积的总和，即凝胶颗粒外水体积Vo、凝胶颗粒内部的体积Vi和干凝胶颗粒体积Vg之和：Vt=Vo+Vi+Vg。
Vt可从柱的直径d和高度h计算：1/4πd2h。
用有效分配系数（Kav）代替Kd，其定义为：
本实验使用蓝色葡聚糖凝胶Sephadex G-50，其适用的相对分子质量范围在500～10000葡聚糖（线性分子）和1500～30000之间的多肽与蛋白质的分离。
已含蓝色葡聚糖2000（相对分子质量在200万以上，呈蓝色）、细胞色素C（相对分子质量12400，呈红色）、铁氰化钾[K3Fe(CN)6，相对分子质量329.26，呈黄色]的混合液做样品。当混合液流经G-50色谱柱时，三种有色物质因Kd不同，分级分离明显可见。
通过作洗脱曲线可以计算出凝胶层析的特性参数。
III. 实验试剂与仪器
1.实验试剂
Sephadex G-50，蓝色葡聚糖-2000，细胞色素C，铁氰化钾K3[Fe(CN)6]，洗脱液Tris-HCl（0.05mol/L pH 7.5）。
2.实验器材
层析玻璃管（1cm×20cm），试管，烧杯，注射器，滴管、微量移液器，玻璃棒等。
IV. 实验操作步骤
1. 凝胶溶胀 称取3gSephadex G-50加入到50mL 蒸馏水中，沸水溶胀2h。
用倾斜法除去凝胶上层水及细颗粒，以蒸馏水反复倾洗3～4次（此时无细小颗粒），再用0.05mol/L Tris-HCl（pH 7.5）洗脱洗涤后，将凝胶保存在洗脱液内。
2. 装柱 将层析柱垂直地安装好，柱内装入洗脱液（dH2O），排除层析柱板下的空气泡，关闭底部出口，柱内留下约柱体积四分之一的洗脱液。加入搅拌均匀的Sephadex G-50的浆液，浆液不可太稀或太粘稠。装填时用一根玻璃棒，让浆液沿玻棒流入柱内（注射器灌柱，控制高度），同时打开柱底部出口，调流速0.3mL/min（10～12滴/min）。
凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，不断补入均匀的浆液直到凝胶床高15cm为止，关闭出口。操作过程中注意决不能让凝胶床表面露出液面，装填时尽量一次装完，防止凝胶床出现“纹路”和气泡。
（注：凝胶装填完毕后，剪一张滤纸片置于凝胶上端）
3. 加样 用洗脱液分别配成6mg/mL的 蓝色葡聚糖-
2000、8mg/mL的细胞色素C、5mg/mL的铁氰化钾三种溶液，然后三种溶液等体积混匀，取0.18mL混合液上样。先用滴管吸去凝胶床上面大部分液体，打开出口使洗脱液恰好流到床表面为止，关闭出口（打开开关将多余液体放至滤纸，关闭开关加入洗脱液，洗柱调节流速10～12滴/min），（将柱内洗脱液放至滤纸，不得残余液体，取混合样品加入柱内）用滴管（滴管使用原则：尽量接近凝胶面或液面，垂直悬空靠近）小心地将上述样品加于柱床上成一薄层，切勿搅动床表面（一次加入柱内，将样品全部加入柱内至滤纸，关闭开关加入适量洗脱液，开始收集）。打开出口使样品溶液渗入凝胶内，并开始收集并计量流出液体积。当样品溶液流至与凝胶界面相平时，立即用滴管取极少量洗脱液轻轻冲洗管壁两次，使残余样液全部渗入凝胶床内，当液面降至床表面时，再加入洗脱液进行连续洗脱。
4. 洗脱与收集 调节洗脱液流速为0.3mL/min（10～12滴/min）（已完成），仔细观察记录样品在层析柱内的分离现象，收集并量取洗脱液体积，当收集达6.0mL时，换小试管每隔0.3mL收集一管，用肉眼观察颜色深浅，以“-、+、++、+++”符号记录三种物质洗脱液的颜色变化。（注：先出液收集：只记滴数。
蓝色色带接近凝胶底部开始收集。每管20滴）
V. 实验结果分析
1.绘制洗脱曲线：
以洗脱体积为横坐标，洗脱液的颜色强度为纵坐标作洗脱曲线。
洗脱液颜色强度变化表
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
蓝色葡聚糖
-
+
+++
+
-
-
-
-
-
细胞色素C
-
-
-
+
+++
++
++
++
++
铁氰化钾
-
-
-
-
-
-
-
-
-
管号
10
11
12
13
14
15
16
蓝色葡聚糖
-
-
-
-
-
-
-
细胞色素C
+
+
-
-
-
-
-
铁氰化钾
+
+
+++
++
+
+
-
2.计算凝胶柱Vt、Vo及各成分的Ve和Kav
①每滴0.05mL 每管20滴 未收集部分的体积98滴 98×0.05mL=4.9mL
②外水体积 Vo=4.9+0.05×20+0.05×20=6.9mL
柱体积 Vt=4.9+0.05×4×20+0.05×2×20/2=9.9mL
③K蓝色葡聚糖-2000=Ve－Vo/Vt－Vo=0（Ve=Vo）
K铁氰化钾=Ve－Vo/Vt－Vo=1（Ve=Vt）
VI. 注意事项
1.平时放置冰箱，取出放室温；
2.架柱垂直防漏放一半dH2O；
3.凝胶使用完毕回收。。