网站地图
【www.arisingsemi.com--实用文档】
胚乳细胞 稻麦糊粉层细胞发育及功能张文虎（M05305） 导师：王忠教授
（扬州大学植物生理教研室225009）
水稻小麦是世界粮食作物，其重要地位是毋庸置疑的。其胚乳是人类食粮、禽畜饲料、食品工业原料的重要来源。胚乳的发育状况决定着谷物的产量与品质。
依据细胞在胚乳组织中所处的位置和功能，我们将谷物胚乳细胞分为两种类型：一是内胚乳细胞，占胚乳组织的90%以上，其生理功能主要贮藏淀粉和蛋白质等物质，为胚发育提供营养。二是胚乳表层细胞，占胚乳组织的5%～10%，发育后转化成来糊粉层细胞(aleurone layer cell)（图版Ⅰ，图版Ⅱ）和胚乳转移细胞(endosperm transfer cell) 。在萌发时糊粉层细胞受赤霉素的诱导能合成大量的水解酶类，扩散进入内胚乳细胞分解胚乳细胞中的贮藏物质供胚发育的需要。萌发后糊粉层细胞发生程序性细胞死亡，本身含有的物质解体后也被胚吸收。关于谷物胚乳和糊粉层的发育及其功能的研究，国内外已有很多的报道［1～40］，但大多是对结构变化的描述，而关于胚乳表层细胞如何转化成糊粉层细胞机制的研究很少。
1.选题依据
1.1关于糊粉层细胞的发育和结构特点
王忠等
（1998）用光学显微镜和电子显微镜观察了水稻胚乳的发育，指出糊粉层是由胚乳表层细胞在吸收转运灌浆物质的过程中积累了其中的矿质、脂类和蛋白质等物质后演化而成的［5］; 也指出糊粉粒是由液泡积累蛋白质、植酸钙镁颗粒等后发育起来的，而圆球体起源于粗糙内质网，积累磷脂、糖脂和中性脂肪。然而，关于糊粉层发育的成因尚未见较详细的报道。
糊粉层细胞与内胚乳细胞相比，糊粉层细胞一般不含淀粉，而含有大量蛋白质、脂质、矿质和维生素。例如，小麦糊粉层中蛋白质含量约18%，脂肪的含量6%～10%。
蛋白质、维生素和矿等物质主要存在由单层膜包裹的糊粉粒［5，6］中，而脂质存在只有半层膜包裹的圆球体［7］中。糊粉粒的颗粒较大，而圆球体小而多（图版Ⅰ）。
1.2关于糊粉层的生理功能
1.2.1转运与积累养分功能。
在胚乳细胞发育和充实过程中，灌浆物质必须通过糊粉层才能进入胚乳细胞。
另外，在胚乳中，糊粉层是积累养分最早的组织。
1.2.2产生水解酶分解胚乳为胚生长提供养分的功能。
一般认为在种子发芽过程中，由胚释放出赤霉素，诱发糊粉层产生淀粉酶、蛋白酶等水解酶，这些水解酶分解胚乳中淀粉和蛋白质等贮藏物质［16］，在为胚生长提供养分方面起着重要的作用。也有人指出，糊粉层中的α-淀粉酶与穗发芽密切有关，糊粉层细胞合成α-淀粉酶能力低的品种抗穗发芽，反之则易发生穗发芽。
然而，尚需进一步研究糊粉层细胞中激素信号的传导、水解酶的基因表达和活性调节等方面的问题［12，17］。
糊粉层产生水解酶分解小麦胚乳细胞中的蛋白质和淀粉体的扫描电镜照片
1.未被水解酶分解的胚乳细胞中的淀粉体和蛋白质，内含大小两种淀粉体和蛋白质。2.在种子萌发过程中，胚乳细胞中蛋白质首先被水解酶降解，淀粉体尚完整。3. 淀粉体开始水解时淀粉体表面出现一些小孔。4. 处于水解中的淀粉体，淀粉体上出现许多大孔。5. 处于水解后期的淀粉体，由于淀粉体内淀粉大量被消耗，淀粉体收缩和消亡。a.淀粉体；p. 贮存在淀粉体间隙中的蛋白体；（顾蕴洁2005）
1.3糊粉层的营养价值
双向电泳分析大麦种子各组织的蛋白质组分，结果表明糊粉层和胚中蛋白质不仅含量高，而且种类比胚乳中的多。香气的物质也主要存在于糊粉层中［27］。谷物种子中的磷大部分以植酸(肌醇六磷酸脂)形式贮藏于糊粉层的糊粉粒中
现已成功地从麦麸中分离出细颗粒状的糊粉层物质，纯度达96%以上。无味 ,口感好,不仅可以单独食用，也能作食品添加剂［26］。
近年来, 随着粮食安全保障问题严峻，以及人们对谷物产量、品质和卫生安全无公害的进一步要求，对于环境中重金属的存在对作物生长的影响及其与谷物糊粉层的关系的研究也越发重视和深入［36～38］。
如果能确定糊粉层是重金属元素的积聚部位，那么只要对稻麦籽粒进行深度加工，彻底去除糊粉层，就能避免或减轻重金属在食粮中的污染；对于某些已受到一定污染程度谷物或许也能加以合理利用。
综上所述，本项目将在借鉴他人和总结我们实验室以往工作的基础上，拟进一步探明谷物胚乳发育过程，弄清表层细胞和内胚乳细胞超微结构的特点，进一步探明糊粉层细胞分化过程以及影响因素，弄清其生理功能和调节机理。阐明谷物胚乳发育、转化和充实的规律，为谷物生产提供理论和方法。
2.研究内容
2.1糊粉层的分化与充实
我们将进一步以稻麦颖果为材料，观察胚乳组织中由胚乳表层细胞转化成糊粉层细胞次序和详细过程，以及其中糊粉粒和圆球体的形成和充实过程；设置向颖果输送 “灌浆废物”的量（如增施N素和P、K、Mg等矿质元素的量），测定“灌浆废物”在胚乳各部分分布；设置改变粒重的试验（如选种粒重差异的品种，进行增“库”减“源”处理）比较粒重与糊粉层充实关系。验证糊粉层细胞是胚乳表层细胞囤积“灌浆废物”后转变来的观点。
另外通过组织化学和分子生物学方法研究内胚乳细胞和表层细胞的化学组成，酶蛋白和核酸种类以及墓基因表达等方面的差异，分析胚乳细胞转化成糊粉层细胞控制因素和发育信号。
2.2糊粉层的生理功能
对不同发育阶段的稻麦子粒，按照预先设定的实验方案，拟进一步从糊粉层细胞的超微结构，如细胞壁、质膜、胞间连丝、内膜系统的结构特点分析糊粉层的吸收和转运灌浆物质的生理功能，以及研究在糊粉粒和圆球体的发育过程中糊粉层囤积“灌浆废物”的生理功能。
在种子萌发过程中，糊粉层会产生α-淀粉酶、蛋白酶等水解酶，对水解内胚乳贮藏物质供胚生长起着重要作用。通常认为糊粉层中水解酶的产生由胚分泌的赤霉素诱导。
我们拟进一步研究糊粉层细胞在种子萌发过程中的生理功能和程序性死亡。
3．研究方案：
3.1糊粉层细胞的发育和功能的研究方案：
3.2关于论证糊粉层分化与灌浆废物沉积相关的研究方案
3.3关于阐明内胚乳细胞和糊粉层细胞结构和发育特点差异的研究方案
3.4关于探讨糊粉层对种子萌发的作用方案
4.实验材料与方法
本试验选用水稻和小麦为材料，选用常规水稻和小麦品种：扬粳9538，优118以及扬稻6号；小麦为扬12和扬15。
限源限库与不同施氮处理等结合，采用记号笔点开颖颖花与植株上挂牌相结合的方法来标记颖花的开花日期与授粉时刻。在开花期每天标花，直标到全田开花结束，这样能在某一天里采集到发育不同天数或授粉后不同时间的颖果，进行多项实验
4.1糊粉层细胞成分和酶的组织化学检定
取发育不同天数的谷物颖果或萌发不同天数的颖果，冰冻切片。
用检测试剂染色，在显微镜观察。根据呈色情况，判断糊粉层细胞成分和酶的定位。也可采用免疫荧光法对糊粉层细胞中的激素等物质定位。根据细胞成分和酶活性在糊粉层发育过程中的变化，就可分析糊粉层的发育过程和部分生理功能。
4.2供光镜和透射电镜(TEM)观察的样品制作
将发育不同天数的颖果或萌发不同天数的种子的观察部位切成薄片,用2% GAL(戊二醛)、1% PAL(多聚甲醛)、0.05mol/L pH 7.2 CaCO(甲基砷酸钠)缓冲液,前固定3小时,后用1%锇酸后固定数小时,乙醇系列脱水,环氧丙烷置换,用低粘性的Spurr树脂浸透与包埋,先切1μm半薄切片,用1% TBO(甲苯胺兰)染色,供光镜观察,在光镜观察确定需要作超微结构观察的部位的基础上,进一步作超薄切片(50nm),用6%醋酸铀和佐滕氏铅混合液,双重染色,用TEM观察样品的超微结构（如图版Ⅰ、Ⅳ所示）。为了探明糊粉层和转移细胞的发育和生理功能，要着重观察与物质积聚有关的糊粉粒、圆球体等细胞器，与物质输导有关的细胞壁、胞间连丝等细胞器超微结构随颖果发育的变化
4.3细胞壁的荧光观察
取发育不同天数的颖果，固定、用Leica 7022 LH树脂包埋，制作切片，用0.1%荧光增白剂溶液染色10分钟，清洗后将切片放在荧光显微镜下用紫外光激发观察，发出的蓝色荧光的部位为细胞壁 (图版Ⅵ)。用此法可以观察糊粉层细胞壁发育情况。
4.4供扫描电镜(SEM)观察的样品制作
把开花后不同日数的颖果先用3% GAL、1.4% PAL、0.05mol/L pH7.2 CaCO固定,然后用1% 锇酸固定,二甲亚砜过渡,在液氮中断裂,丙酮脱水,醋酸异戊酯过渡,CO2临界点干燥,离子溅射镀金制样后用SEM观察它们的断面结构，分析子粒萌发过程中的糊粉层消耗情况，从而分析糊粉层在子粒萌发中的功能
4.5谷物种子中矿质元素分布分析
采用电子探针法。
利用我校测试中心附有能谱仪的扫描电镜，在观察断面结构的同时，分析观察区中的矿质元素种类与含量
4.6胚乳细胞的分离与核酸与蛋白质成分分析
取发育不同天数的颖果（最适宜酶解胚乳细胞的材料是花后10天左右的稻麦颖果）。剥去果皮与胚。
将胚乳组织用纤维素酶和果胶酶酶解，首先解离下来的是糊粉层细胞，其次是内胚乳细胞。用显微镜可观察两种胚乳细胞形态。
如分别提取两种细胞中内含物，用电泳等方法分离与鉴定其中核酸与蛋白质的种类和特异性。
4.7糊粉层在种子萌发过程中结构和功能的观察
每隔2d将吸足水分的稻麦等种子播于附有湿砂的培养皿中发芽，当首批播种的小苗长至3叶期（断乳期）时，收集萌发不同天数的种子。采用上述大多数方法可用于研究糊粉层在种子萌发过程中超微结构的变化，分析糊粉层细胞的生理功能
4.8灌浆物质进入胚乳途径的观察
取发育15天数左右的小麦或水稻穗，留下同一天标花的颖果，其余全部剪除。将穗茎插入含有14C-蔗糖液中，每隔半小时取下颖果后冰冻切片，将切片贴在玻片上，烤干后在切片上涂感光乳胶，进行同位素自显影，根据浸穗不同时间后颖果横切面自显影显微观察到的情况，分析14C-蔗糖液到达颖果各部位的时间与进入胚乳途径。
用小麦穗实验，浸穗约20分钟14C-标记物出现在子房维管束，1小时14C-标记物进入胚乳。
另外也可用荧光显微法观察灌浆物质进入胚乳途径。
例如给小麦或水稻小穗饲喂荧光示踪物如小分子量的葡聚糖，每隔半小时取出颖果后徒手切片，在荧光显微镜下观察颖果横切面上由葡聚糖分子发出的绿色荧光，由此可分析灌浆物质进入胚乳途径。
5、年度研究计划及预期研究结果
5.1 研究计划
基于今年暑假的实验情况，拟定：
1、2006.12~2007.4利用实验室的光照培养箱进行子粒萌发操作，以研究糊粉层的功能。
2、2007.4~2007.8进行小麦的田间取样以及实验室分析工作，研究小麦糊粉层的发育。
。